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检测HIV‑12‑LTRDNA的PCR引物组、探针及其试剂盒和检测方法与流程

作者: 艾查网 更新时间: 2020年11月09日 01:48:55 游览量: 112

简述:

本发明属于生物技术领域,具体涉及病毒检测领域,更具体涉及一种检测人类免疫缺陷病毒1型2-LTR DNA的PCR引物组、探针及其试剂盒和检测方法。 背景技术: 人类免疫缺陷病毒(Human

检测HIV‑1 2‑LTR DNA的PCR引物组、探针及其试剂盒和检测方法与流程


本发明属于生物技术领域,具体涉及病毒检测领域,更具体涉及一种检测人类免疫缺陷病毒1型2-LTR DNA的PCR引物组、探针及其试剂盒和检测方法。



背景技术:

人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒(Lentivirus),属反转录病毒的一种。1983年,人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。该病毒破坏人体的免疫能力,导致免疫系统失去抵抗力,从而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存,发展到最后,导致艾滋病。据不完全统计,全球估计有3590至4430万人与人类免疫缺陷病毒相伴生存,其中430至640万人属于新发感染病例,另外,有280至350万人死于艾滋病。

近年来,联合抗逆转录病毒疗法(cART)或者高效抗反转录病毒治疗(HAART)能有效阻断人类免疫缺席病毒(HIV)感染患者体内的病毒复制,使血浆中病毒载量,低于一般检测的检出限。最近有报告的结果表明,一些患者体内的病毒可能会继续复制,但其病毒水平过低无法检测到。同时发现,当治疗中断时会出现血浆病毒载量快速反弹的情况(Butler,S.L.,Hansen,M.S.,and Bushman,F.D.(2001).A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.Nat Med 7,631-634.)。

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)储存库的持续存在主要是由于HIV-1DNA导致的。在HIV的整个生命周期里,DNA的存在形式包括:线性非整合DNA、环状非整合DNA(1-LTR,2-LTR)、整合的前病毒等。其在细胞核内的含量为:线性非整合DNA>整合前病毒>1-LTR>2-LTR。一般感染HIV-1 3-4h后,可检测到HIV-1 DNA,再过1h,整合DNA开始累积,但仅占总HIV-1 DNA的10%,大约8-12h之后,线性非整合DNA含量达到最高峰,此时环状非整合DNA(1-LTR,2-LTR)可被检测到,1-LTR和2-LTR仅占总HIV-1 DNA的10%和1%(Butler,S.L.,Hansen,M.S.,and Bushman,F.D.(2001).A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.Nat Med 7,631-634.Kim,S.Y.,Bym,R.,Groopman,J.,and Baltimore,D.(1989).Temporal aspects of DNA and RNA synthesis during human immunodeficiency virus infection:evidence for differential gene expression.J Virol63,3708-3713.Vandegraaff,N.,Kumar,R.,Burrell,C.J.,and Li,P(2001).Kinetics of human immunodeficiency virus type 1(HIV)DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.J Virol 75,11253-11260.)。

近年来的研究表明,2-LTR的含量的高低与HIV感染宿主细胞的过程密切相关,是极其重要的生物标志物(Bukrinsky M,Stanwick T,Dempsey M,Stevenson M:Quiescent T lymphocytes as an inducible virus reservoir in HIV-1infection.Science 1991,254:423-427.Shoemaker C,Goff S,Gilboa E,Paskind M,Mitra SW,Baltimore D:Structure of a cloned circular Moloney murine leukemia virus DNA molecule containing an inverted segment:implications for retrovirus integration.Proc Natl Acad Sci USA 1980,77:3932-3936.Zheng Y,Ao Z,Wang B,Danappa Jayappa K,Yao X:Host protein Ku70binds and protects HIV-1 integrase from proteasomal degradation and is required for HIV raplication.J Biol Chem 2011,286:17722-17735.Kilzer JM,Stracker T,Beitzel B,Meek K,Weitzman M,Bushman FD:Roles of host cell factors in circularization of retroviral dna.Virology 2003,314:460-467.Bukrinsky MI,Sharova N,Dempsey MP,Stanwick TL,Bukrinskaya AG,Haggerty S,Stevenson M:Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1preintegration complexes.Proc Natl Acad Sci USA 1992,89:6580-6584.)。

HIV-1 2-LTR仅存在于宿主细胞核中,因此它已经成为病毒入核的重要标志,其由线性DNA的长末端重复序列(LTR)的非同源性末端接合而成。以2-LTR为检测指标的原因是:HIV-1病毒没有维护2-LTR的机制,因此其很容易被降解掉,这意味着感染是近期的。尽管其含量较低,由于其LTR-LTR的连接的独特性质,可以比较容易的被实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,QPCR)检测到,而且特异性极高(Bukrinsky MI,Sharova N,Dempsey MP,Stanwick TL,Bukrinskaya AG,Haggerty S,Stevenson M:Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1preintegration complexes.Proc Natl Acad Sci USA 1992,89:6580-6584.Butler S,Hansen M,Bushman F:A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.Nat Med 2001,7:631-634)。短期的体外实验表明2-LTR是稳定的,而体内的分析则证明其性质是不稳定的,这支持了2-LTR作为检测ART治疗后残留的病毒的一种生物标志物,同时也可以被用于作为标志新感染细胞的一个有效替代品(Sharkey ME,Teo I,Greenough T,Sharova N,Luzuriaga K,Sullivan JL,Bucy RP,Kostrikis LG,Haase A,Veryard C,et al:Persistence of episomal HIV-1infection intermediates in patients on highly active anti-retroviral therapy.Nat Med 2000,6:76-81.Sharkey M,Triques K,Kuritzkes DR,Stevenson M:In vivo evidence for instability of episomal human immunodeficiency virus type 1 cDNA.JVirol 2005,79:5203-5210.)。有实验证明,在抗逆转录病毒治疗(ART)中断前与治疗后中断的反弹的序列相同,均来自于游离的HIV DNA,而非前病毒DNA,强调了2-LTR作为标记的动态特征(Sharkey M,Babic DZ,Greenough T,Gulick R,Kuritzkes DR,Stevenson M:Episomal viral cDNAs identify a reservoir that fuels viral rebound after treatment interruption and that contributes to treatment failure.PLoS Pathog 2011.7:e1001303)。

文章链接:http://www.gszyldy.com/jc/14886.html

文章标题:检测HIV‑12‑LTRDNA的PCR引物组、探针及其试剂盒和检测方法与流程